1993年，比利時布魯塞爾自由大學(xué)免疫學(xué)家Hamers-Casterman教授以及他的同事們在駱駝（駱駝科，后來研究證實(shí)也包括單峰駱駝和羊駝）的血清中發(fā)現(xiàn)了一種與傳統(tǒng)抗體結(jié)構(gòu)不同的新型抗體，這種抗體僅僅由兩條重鏈構(gòu)成，被稱為重鏈抗體(heavy-chain antibody, HCAb)。重鏈抗體的重鏈的可變區(qū)稱為VHH(variable domain of heavy chain of heavy-chain antibody)，通過體外重組表達(dá)制備的VHH分子質(zhì)量僅僅為15kDa，是傳統(tǒng)抗體的十分之一左右，是抗原結(jié)合片段（scFV，VH-VL）的二分之一左右，因此被稱為納米抗體(nanobody, Nb)。

納米抗體的篩選和制備

1、納米抗體基因文庫的構(gòu)建

抗原特異的納米抗體可以通過免疫庫、天然庫或合成庫產(chǎn)生，其中免疫庫的構(gòu)建常用的納米抗體開發(fā)技術(shù)。

用純化的靶抗原對羊駝進(jìn)行免疫，免疫成功后在羊駝血液中提取包含成熟B細(xì)胞的淋巴細(xì)胞。抽提淋巴細(xì)胞的RNA并反轉(zhuǎn)成cDNA文庫，利用特殊設(shè)計(jì)的引物在cDNA文庫中再次進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到特異的基因片段；隨后將特異的基因片段拼接重組在噬菌體載體上，并轉(zhuǎn)染大腸桿菌，最終完成納米抗體基因文庫的構(gòu)建。

2、特異性抗體的篩選將靶點(diǎn)抗原或者帶有抗原的物質(zhì)直接/間接的固定在固體載體上，隨后加入噬菌體文庫和抗原相互作用。作用一段時間后陽性噬菌體會和抗原結(jié)合，用洗滌液洗滌固體載體表面，可以將未結(jié)合或非特異結(jié)合的噬菌體洗去。隨后用強(qiáng)酸或者強(qiáng)堿破壞固體載體上抗原和陽性噬菌體的結(jié)合，從而得到陽性噬菌體溶液。一般重復(fù)進(jìn)行2-3輪的篩選即可獲得符合開發(fā)要求的納米抗體克隆。

3、納米抗體的生產(chǎn)制備

獲得符合要求的抗體克隆后需要進(jìn)行抗體的大規(guī)模生產(chǎn)制備。納米抗體的生產(chǎn)制備是DNA轉(zhuǎn)錄到mRNA然后翻譯成蛋白的過程。由于抗體具有復(fù)雜的結(jié)構(gòu)，因此在表達(dá)體系中需要復(fù)雜的細(xì)胞器來完成正確的表達(dá)、折疊和加工。目前，在工業(yè)界有一系列成熟的表達(dá)體系可用于抗體表達(dá)，不同的表達(dá)體系之間各有優(yōu)劣勢差異。抗體設(shè)計(jì)的*功能表達(dá)和純化是決定它們實(shí)現(xiàn)應(yīng)用命運(yùn)的關(guān)鍵因素，因此選擇合適的表達(dá)體系是獲得最大收益的重要環(huán)節(jié)。

哺乳動物細(xì)胞系由于免疫原性低，且其細(xì)胞器可提供*的折疊、分泌和翻譯后修飾，是治療性抗體的shou選表達(dá)系統(tǒng)，但同時存在生產(chǎn)成本高、技術(shù)難度大等缺陷；大腸桿菌表達(dá)體系由于其便利的生產(chǎn)和操作、快速的生產(chǎn)周期以及成熟的平臺體系zui歡迎，然而，由于氧化氛圍和折疊能力的限制，大腸桿菌不能表達(dá)具有復(fù)雜結(jié)構(gòu)和富含二硫鍵的重組抗體；酵母是另一個普遍使用的微生物表達(dá)宿主，其結(jié)合了原核表達(dá)系統(tǒng)的優(yōu)勢（周期短、成本低、操作簡單）和真核表達(dá)系統(tǒng)的優(yōu)勢（正確的折疊、修飾和分泌），使得它成為zui歡迎的可表達(dá)全長IgG或者其他抗體形式的宿主。還有其他一些系統(tǒng)可用于表達(dá)重組抗體，比如絲狀真菌、藻類、原蟲、昆蟲細(xì)胞、轉(zhuǎn)基因植物和動物，其中對轉(zhuǎn)基因植物和動物的研究處于相對初始的階段，需要進(jìn)一步的深入研究。對于納米抗體，由于其結(jié)構(gòu)簡單，水溶性較好，因此可以利用成本比較低的細(xì)菌表達(dá)系統(tǒng)和酵母表達(dá)系統(tǒng)進(jìn)行大量生產(chǎn)。例如，比利時Ablynx公司建立了成熟的畢赤酵母表達(dá)和純化工藝。納米抗體在哺乳動物細(xì)胞系中生產(chǎn)鮮有報(bào)道，因?yàn)樯a(chǎn)成本的昂貴會限制該體系的發(fā)展。在植物和動物體內(nèi)進(jìn)行納米抗體生產(chǎn)也有大量的研究報(bào)道，跟傳統(tǒng)抗體生產(chǎn)體系相似，這兩種體系生產(chǎn)的納米抗體具有成本低、污染少安全性高的特點(diǎn)，具有潛在的應(yīng)用價(jià)值。